Polarité Cellulaire, Signalisation et Cancer

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Les mitochondries nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le cancer du pancréas -

Plus de 90% des tumeurs humaines chez l’adulte ont pour origine la transformation maligne de cellules épithéliales par la dérégulation de gènes appelés oncogènes et gènes suppresseurs de tumeur. Ces évènements moléculaires altèrent la morphologie et la fonction de tissus devenus cancéreux et confèrent aux cellules tumorales une capacité à quitter la tumeur primaire pour envahir des organes distants. Cette dissémination, à l’origine de la formation des métastases, est difficilement jugulée par les traitements actuels et entraine un pronostic sombre chez la plupart des patients.

NOTRE RECHERCHE
EN BREF

Le phénotype tumoral comprend souvent une altération de la polarité cellulaire des tissus épithéliaux, une augmentation de la migration et de la résistance à l'apoptose des cellules tumorales et, finalement, la formation de métastases. La polarité cellulaire est un processus fondamental qui s'amorce au cours du développement embryonnaire et se maintient tout au long de la vie adulte. Les tissus épithéliaux se forment selon deux axes de polarité : la polarité apico-basale (PAB) qui construit des couches uni- ou multi-cellulaires polarisées, et la polarité cellulaire planaire (PCP) qui est perpendiculaire à la PAB et nécessaire à la morphogenèse des tissus. La base génétique de la PCP a été historiquement élucidée chez la drosophile, ce qui a permis la caractérisation de nombreux gènes conservés au cours de l'évolution qui codent pour des récepteurs membranaires (tels que PTK7, VANGL1 et VANGL2), des ligands WNT, des adaptateurs cytoplasmiques (tels que SCRIBBLE et PRICKLE1) et des protéines kinases (MINK1) appartenant à la voie de signalisation WNT non canonique. Cependant, la compréhension du mode d'action des protéines WNT/PCP est encore superficielle. Etant donné que la signalisation WNT/PCP joue un rôle essentiel dans la dissémination et l'agressivité du cancer, ses composants et les voies associées pourraient devenir des cibles thérapeutiques très importantes à l'avenir.

Depuis de nombreuses années, notre équipe se concentre sur l'étude des gènes WNT/PCP SCRIBBLE (et ses homologues ERBIN et LANO), PTK7 et VANGL2 ainsi que sur le suppresseur de tumeurs LKB1 dont l'implication dans la signalisation AMPK et WNT est bien documentée. Notre équipe a contribué de manière significative à l'identification des réseaux moléculaires associés à ces molécules dans des situations physiologiques et tumorales, et a démontré l'implication de VANGL2, PRICKLE1, PTK7 et ERBIN dans divers cancers. Notre objectif est de poursuivre nos études fondamentales sur le mode d'action de ces protéines en utilisant des méthodes de biologie cellulaire, protéomique et génétique et d'évaluer leur implication dans le cancer en utilisant nos modèles de souris ainsi que les ressources et expertises cliniques de l'Institut Paoli-Calmettes.

RESULTATS & PROJETS
Rôles des protéines de la famille LAP dans le développement et les cancers

Notre équipe a caractérisé une famille de protéines d'échafaudage cytoplasmiques (LAP pour Leucine-Rich Repeats et PDZ domains) impliquées dans la polarité des cellules épithéliales qui comprend ERBIN, SCRIBBLE et LANO (revue dans Oncogene 2020). ERBIN est composée de domaines LRR (Leucine Rich Repeat) et d’un domaine PDZ (PSD95-DLG-ZO1), ce dernier interagit avec l'extrémité carboxy-terminale du récepteur oncogène ERBB2/HER2 tyrosine kinase (RTK). Nous avons démontré le rôle d'ERBIN sur l'oncogénicité d’ERBB2/HER2 dans le sein (PNAS 2014), la peau (en coll. J. Cell Biol. 2015), le côlon (en coll. Cancer Research 2018), son implication dans la dermatite allergique sévère (en coll. J. Allergy Clin. Immunol. 2018) et dans les fonctions cardiaques (en coll. PNAS 2014) et nerveuses (en coll. Nature Neurosc. 2013). L'interaction ERBIN-ERBB2/HER2 stabilise le récepteur en augmentant sa dimérisation au niveau de la membrane plasmique et est nécessaire à la prolifération cellulaire et à l'oncogénicité in vitro et in vivo (PNAS 2014). De plus, Les souris erbin-/- ont une lactation défectueuse en raison d'une activation réduite de la voie de signalisation du récepteur de la prolactine dans les glandes mammaires, similaire à celle observée chez les souris déficientes en erbB4, prlr ou prl. Nous disséquons les mécanismes moléculaires impliqués dans ce défaut, en tirant parti de partenaires protéiques d'ERBIN déjà connus.

Nous avons contribué à montrer le rôle de SCRIBBLE dans la plasticité neuronale (en coll. Cerebral Cortex 2017) et identifié VANGL2, un acteur central de la voie WNT/PCP, comme un intéracteur de SCRIBBLE grâce au crible du PDZome humain (Mol. Cell. Proteomics 2013 ; en coll. Nat. Methods, 2015). Nous avons aussi identifié SCRIBBLE comme un régulateur négatif de la voie WNT/b-caténine (Proteomics, 2019).

Un autre objectif important est d'étudier les interactions génétiques entre les trois membres de la famille LAP (erbin, scribble et lano) chez la souris. Les souris mutantes pour scrib (scrib-/-) présentent une anomalie majeure de fermeture du tube neural entraînant une mortalité périnatale, tandis que les souris erbin-/- et lano-/- sont viables et fertiles. Une redondance fonctionnelle peut expliquer ces résultats. Afin de comprendre les fonctions spécifiques de chaque membre de la famille LAP, des doubles knockouts produits chez la souris sont en cours d'évaluation ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués.

La plupart des cancers, y compris les tumeurs mammaires, contiennent une population de cellules souches cancéreuses auto-renouvelables (CSC) qui stimulent la croissance tumorale, résistent aux thérapies conventionnelles et initient le développement de métastases. Nous avons récemment identifié LANO comme un régulateur négatif de l'expansion des cellules souches mammaires normales et cancéreuses, en partie en supprimant la sécrétion de ligands WNT (Stem Cell Reports, 2018). Nous étudions actuellement le mécanisme moléculaire qui sous-tend cette nouvelle fonction de LANO par des méthodes biochimiques et de biologie cellulaire. De plus, la chimiorésistance et la radiorésistance des CSC, dues au moins en partie, à un microenvironnement cellulaire (niche) les protégeant des traitements cytotoxiques, sont considérées comme la principale cause de rechute en association avec leur implication dans la dissémination métastatique. Cependant, le rôle des forces physiologiques dans la régulation du sort des CSC a été peu étudié. Un projet collaboratif et interdisciplinaire Capostromex financé par A*MIDEX définira les relations entre les propriétés viscoélastiques mécaniques du stroma sur le comportement du CSC dans la tumorigenèse et la contribution de Scrib et Lano, tous deux associés au maintien du contingent de CSC.

Nouvelles voies de signalisation associées à VANGL2

Chez la souris, scribble interagit génétiquement avec vangl2, un gène codant pour un régulateur central de la voie de signalisation WNT/PCP. Nous avons entrepris une stratégie protéomique pour identifier les réseaux de protéines associés à ces composants WNT/PCP et avons étudié leur contribution dans le cancer. Nous avons découvert que VANGL2 est surexprimée dans des cancers du sein de type basal ayant un mauvais pronostic et a la capacité d’interagir avec l'adaptateur p62/SQSTM1, la kinase JNK (Nat. Comm. 2016 + brevet INSERM) ainsi qu'un régulateur de trafic membranaire (en coll., Development 2012 ; Nat. Cell. Biol. 2013). Cependant, le mode d'action de VANGL2 est encore largement inconnu. La purification des protéines associées à VANGL2 dans des cellules de cancer du sein basal nous a permis d'identifier son paralogue VANGL1, et deux co-récepteurs transmembranaires, syndecan-1 et -4, comme partenaires.

Nous avons également effectué une analyse complète du profil de liaison au PDZ de Vangl2 en utilisant un ensemble d'approches cellulaires, biochimiques et biophysiques (Double hybride dans la levure, holdup, SPR, polarisation de la fluorescence). Cela nous a permis de confirmer des partenaires connus du PDZ de Vangl2 et d'en identifier potentiellement des nouveaux. Nous avons également pu documenter la contribution essentielle de certains résidus dans le motif de liaison au PDZ de VANGL2 (Monserrat-Gomez et al., en préparation) et le rôle possible d’événements de phosphorylation se produisant dans cette région de VANGL2. Pour évaluer le potentiel pro-tumorigène de VANGL2, nous avons produit un modèle de souris transgénique surexprimant VANGL2 dans la glande mammaire qui est actuellement évalué expérimentalement. Enfin, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle isoforme de Vangl2, appelée Vangl2-Long, issue d'un site alternatif d'initiation de la traduction non-AUG, en amont du codon d’initiation conventionnel. Cette extension N-terminale de Vangl2-Long est conservée chez tous les vertébrés mais absente dans le paralogue Vangl1 et agit probablement comme un signal de rétention dans l'appareil de Golgi. Nos données biochimiques et fonctionnelles indiquent que VANGL2-Long forme un complexe multimérique avec VANGL1 et VANGL2 et que sa régulation négative conduit à des défauts de fermeture du tube neural en lien avec le rôle connu de la PCP chez les embryons de xénope, dévoilant ainsi un nouveau niveau de complexité dans l'expression, le trafic et la fonction de VANGL2 (Walton et al., soumis à publication).

 

PRICKLE1, un adaptateur pour VANGL2, est également surexprimé dans le cancer du sein basal et associé à un nouveau complexe RICTOR-MINK1 entraînant l'activation de la kinase AKT et la dissémination cellulaire in vitro et in vivo (Dev. Cell 2016, Cell Cycle 2016 + brevet INSERM) et ECT2, un Rho-GEF, dans le cancer du sein basal (Br. J. Cancer, 2019). Récemment, nous avons découvert que le complexe PRICKLE-MINK1 s'associe à LL5b, une protéine de liaison CLASP et un nouveau substrat de MINK1, impliqué dans la migration cellulaire et le renouvellement des intégrines.

Rôle de PTK7 dans le cancer

Chez la souris scribble interagit génétiquement avec ptk7, un gène codant pour un récepteur WNT/PCP. PTK7 est un récepteur de tyrosine kinase (RTK) surexprimé dans la leucémie myéloïde aiguë de mauvais pronostic et potentiellement impliqué dans la rétention des cellules leucémiques dans la moelle osseuse (Blood, 2010). En utilisant un modèle de souris déficient en ptk7, nous avons confirmé cette hypothèse en démontrant le rôle de ce récepteur dans le homing des cellules hématopoïétiques murines dans la moelle osseuse (J. Immunol., 2016). Nous avons également montré que PTK7 joue un rôle prométastatique dans le cancer du côlon de mauvais pronostic (PLoS ONE, 2015) et qu’il s'hétérodimérise avec ROR2, un autre RTK de la voie WNT non canonique activé par WNT5A (J. Biol. Chem., 2015).

 

PTK7 contribue à l'adhésion, à la migration et à l'invasion des cellules cancéreuses, et est lié à la progression de la tumeur et au mauvais pronostic. Un anticorps médicament-conjugué contre PTK7 induit une régression tumorale soutenue chez la souris et entre actuellement dans un essai clinique de phase II, démontrant le potentiel de ciblage de PTK7 dans le cancer. Cependant, son mode d'action dans le cancer est obscur.

Nous avons utilisé la biotinylation de proximité pour étudier le protéome profond associé à PTK7 dans les cellules cancéreuses du côlon, certaines des protéines biotinylées identifiées par spectrométrie de masse sont actuellement étudiées aux niveaux moléculaire et fonctionnel. Une approche similaire sera utilisée pour identifier le protéome nucléaire associé au domaine PTK7 intracellulaire clivé produit lors de l'activation de métalloprotéinases et de secrétases. Les souris ptk7-/- homozygotes meurent en période périnatale, ce qui empêche l'étude de ptk7 chez les adultes. Nous avons produit une souris déficiente pour ptk7 de manière conditionnelle qui fournira un modèle animal extrêmement précieux pour étudier ptk7 dans des tissus spécifiques, en particulier pour décrypter son rôle dans la cancérogenèse colique (Projet Libre INCa).

En utilisant une cohorte de patients atteints de cancer colorectal (CRC) de l'Institut Paoli-Calmettes, nous avons récemment confirmé que PTK7 est régulée transcriptionnellement dans le CRC primaire et métastatique par rapport aux tissus témoins et que la surexpression de PTK7 est un marqueur indépendant de mauvais pronostic. Nous avons montré que le programme transcriptionnel associé à une régulation positive de PTK7 dans les tissus tumoraux est lié à la migration des cellules tumorales et que PTK7 est surexprimée dans les tumeurs primaires mais pas sur les cellules tumorales circulantes (CTC) isolées à partir de sang de patients. Cela suggère que des molécules de surface spécifiques telles que PTK7 peuvent être temporairement régulées à la baisse sur les cellules cancéreuses lorsqu'elles sont présentes dans la circulation périphérique. Nous avons confirmé cette prédiction dans un modèle de souris récapitulant l'ensemble du processus de progression tumorale, depuis la formation de la tumeur primaire jusqu'au développement des métastases. Les études en cours portent sur les mécanismes impliqués dans la disparition de PTK7 de la surface cellulaire et son rôle dans la résistance à l'anoïkis.

 

Outre les cellules épithéliales, les cellules cancéreuses et les cellules souches hématopoïétiques, PTK7 est exprimée dans des cellules immunitaires telles que les cellules dendritiques (CD). Cependant, sa fonction dans l'immunité et dans le cycle cancer-immunité est largement inconnue. Nous avons commencé à l'étudier en combinant des approches innovantes basées sur la technologie scRNA-seq, la cytométrie spectrale multiparamétrique et le modèle génétique de souris. Ce projet est partiellement financé par la subvention "Emergence 2020" du Canceropôle PACA/Gefluc. Nous avons identifié un groupe de CD, monocytes et macrophages, qui expriment PTK7 dans la peau, le ganglion lymphatique cutané (LN), le mélanome et le LN drainant le mélanome. Ainsi, dans ces tissus, nous réaliserons du CITE-seq, une variante de scRNA-seq qui intègre l'expression de protéines de surface clés avec des données transcriptomiques au niveau de la cellule unique. Nos résultats fourniront une cartographie précise de l'expression de Ptk7 et nous aideront à déduire sa fonction et les voies de signalisation associées dans les cellules immunitaires. Nous évaluons actuellement le rôle de PTK7 dans la migration et la présentation de l'antigène, les principales caractéristiques des CD, ainsi que son impact dans le cancer. Des expériences in vivo seront menées en utilisant une souris déficiente pour ptk7 spécifiquement dans les CD. Chez l'homme, nous avons confirmé que les CD plasmacytoïdes sanguines provenant de donneurs sains expriment PTK7 et nous avons découvert qu'un sous-ensemble de CD conventionnelles peut également exprimer la protéine. Nous étudions maintenant son rôle dans la présentation de l'antigène et nous déterminons si sa présence dans les CD qui s'infiltrent dans les tumeurs peut avoir un impact pronostique sur le cancer.

Nouvelles connaissances sur la signalisation LKB1

Responsable du syndrome de Peutz-Jeghers et considéré pendant un certain temps comme une kinase critique pour l'établissement et le maintien de la polarité épithéliale comme chez les vers et les mouches, nous nous sommes efforcés de dévoiler les fonctions de la sérine/thréonine kinase LKB1 en tant que suppresseur de tumeur particulièrement important dans le carcinome pulmonaire non à petites cellules (CPNPC). Nos travaux ont montré que du LKB1 actif localisé aux jonctions adhérentes pour activer AMPK (Curr. Biol. 2009) est régulé par des forces mécaniques soumises à E-Cadhérine (en coll. Nat. Cell. Biol. 2017). À ce jour, les patients atteints de CPNPC avec perte de la fonction de LKB1 sont associés à un mauvais pronostic étant réfractaires à la chimiothérapie ainsi qu'à l'immunothérapie. Pour décrypter les mécanismes moléculaires par lesquels LKB1 exerce son activité de suppression de tumeur, nous avons choisi d'étudier les mécanismes régulant son activité catalytique. En effet, l'altération de l'activité d’LKB1 dans le CPNPC est probablement sous-estimée puisque, outre les événements mutationnels conduisant à sa perte d’expression ou d'activité, ceux liés à sa dérégulation ne sont pas pris en compte. Pour définir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, nous décryptons en profondeur les mécanismes et la signalisation déclenchés par la perte d'activité de LKB1 en utilisant des approches in vitro et in vivo (souris knockout). Par une stratégie de SILAC, nous avons défini qu’LKB1 affecte la phosphorylation de plusieurs candidats pour réprimer l'activité canonique de WNT trouvée dérégulée dans les tumeurs. Des approches protéomiques complémentaires basées sur le marquage de proximité (APEX) ont également été initiées. Enfin, l'implication de l'activité du LKB1 dans la mécano-transduction et sa pertinence dans des poumons soumis en permanence à des étirements et des tensions associés aux mouvements respiratoires, nous amènent à compléter nos investigations par un projet émergent visant à étudier le rôle des molécules LKB1 et WNT/PCP dans l'agressivité tumorale dans des conditions où la rigidité du microenvironnement tumoral est modifiée (projet interdisciplinaire A*MIDEX Capostromex).